Fundamentos de Bioquímica
Capítulo 05. ESTRUTURA E CATÁLISE – Aminoácidos, Peptídeos e Proteínas
As proteínas são as macromoléculas mais abundantes nas células vivas, ocorrendo em todas suas partes e em grande variedade e com grande diversidade de funções biológicas. São constituídas por unidades monoméricas de aminoácidos.
AMINOÁCIDOS
As proteínas são polímeros resultantes de reações de condensação entre aminoácidos. Os vinte tipos de aminoácidos primários foram descobertos entre 1806 (asparagina) e 1938 (treonina) e receberam nomes triviais.
Os aminoácidos têm características estruturais comuns
Todos os aminoácidos primários são a-aminoácidos, ou seja, têm um grupo carboxila e um grupo amino ligados ao mesmo átomo de carbono (carbono a). Os aminoácidos diferem entre si por suas cadeias laterais (grupos R), os quais variam em estrutura, tamanho e carga elétrica e influenciam suas hidrossolubilidades.
Os carbonos dos aminoácidos são identificados ou por números ou por letras gregas. No primeiro caso, o carbono número 1 é o carbono da carboxila e o carbono 2, o carbono quiral. No segundo caso, o carbono quiral é chamado carbono a e o primeiro carbono da cadeia lateral é chamado b, e assim por diante (g, d, e, ...).
Todos os aminoácidos (exceto a glicina) possuem um carbono quiral (C-a) ao qual está ligado, em um arranjo tetraédrico, um átomo de hidrogênio, uma amina, uma carboxila e um radical variável (grupo R). Os aminoácidos formam ao redor do centro quiral duas configurações possíveis – estereoisômeros enantiômeros. Estas duas formas são chamadas de L-aminoácidos ou D-aminoácidos, segundo se assemelhem ao L- ou D-gliceraldeído, respectivamente. Os aminoácidos também podem ser especificados pelo Sistema RS. Este sistema observa a distribuição dos grupos funcionais ao redor do carbono quiral (R, se a distribuição é no sentido horário, e S, se no sentido anti-horário).
Os resíduos de aminoácidos nas proteínas são L-estereoisômeros
Os aminoácidos primários são sempre L-estereoisômeros porque os sítios ativos das enzimas que os formam são também assimétricos, o que leva à estereoespecificidade das reações por elas catalisadas.
Os aminoácidos podem ser classificados pelos seus grupos R
Os vintes aminoácidos primários podem ser agrupados em cinco classes principais, baseado nas propriedades dos grupos R, em particular sua polaridade.
Grupos R não-polares e alifáticos – São importantes na estabilização das proteínas pela promoção de interações hidrofóbicas em seu interior. Glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina e metionina.
Grupos R aromáticos – Podem participar de interações hidrofóbicas por serem relativamente apolares. Fenilalanina, tirosina e triptofano. Os dois últimos absorvem luz na região ultravioleta do espectro (280nm) e propriedade importante em estudos de laboratório e na caracterização das proteínas.
Grupos R não-carregados, mas polares – São hidrofílicos devido à presença de grupos funcionais hidroxilas (serina e treonina), sulfidrila (cisteína) ou amida (asparagina e glutamina). As ligações dissulfeto têm um importante papel na estabilização de estruturas de muitas proteínas, em virtude da formação de ligações covalentes entre diferentes partes de uma molécula protéica ou entre duas moléculas protéicas distintas.
Grupos R carregados positivamente (básicos) – São muito hidrofílicos e possuem carga positiva. Lisina e arginina. Em muitas reações catalisadas por enzimas, um resíduo de histidina facilita a reação ao servir como doador ou aceptor de prótons.
Grupos R carregados negativamente (ácidos) – são muito hidrofílicos por possuir na molécula um segundo grupo carboxila. Aspartato e glutamato.
Os aminoácidos não-primários também possuem importantes funções
São resíduos de aminoácidos criados por modificação dos resíduos primários já incorporados em um polipeptídeo. Exemplos: 4-hidroxiprolina, 4-hidroxilisina, 6-N-metilisina, g-carboxiglutamato, desmosina e selenocisteína. Além destes, há também centenas de outros aminoácidos adicionais que nunca aparecem em proteínas, dos quais se destacam a ornitina e a citrulina.
Os aminoácidos podem agir como ácidos e bases
Dissolvidos em água, os aminoácidos são íons dipolar, podendo agir como doador de prótons (ácido) ou como receptor de prótons (base), ou seja, são anfóteros ou anfólitos. Um aminoácido monocarboxilico, quando está totalmente protonado, funciona como um ácido diprótico.
Os aminoácidos têm curvas de titulação características
A titulação ácido-base consiste na adição ou na remoção gradual de prótons. À medida que se adiciona aceptores de prótons (base) em uma solução de ácido, o pH da solução aumenta gradualmente até parar de se alterar. A curva característica obtida é chamada curva de titulação. A tendência de um ácido em perder prótons em solução aquosa é chamada de constante de equilíbrio (Keq) que em reações de ionização também é chamada de constante de dissociação (Ka). À medida que a titulação prossegue atinge-se novo equilíbrio na reação reversível de ácido Û base até que não haja mais prótons para serem doados. O pH pára de subir. No ponto médio da titulação, onde exatamente 0,5 equivalente da base foi adicionada, a concentração de doador de prótons havia se igualado à concentração do aceptor de prótons. Neste ponto, o pH da solução é iqual ao pKa do ácido. Ácidos fortes têm mais baixo pKa do que ácidos fracos.
Os ácidos dipróticos apresentam curva de titulação em dois estágios, cada um correspondendo à desprotonação de um grupo doador de prótons. Cada estágio apresenta uma área plana que corresponde ao poder tamponante do ácido. Nestas faixas, o ácido em questão é capaz de manter constante o pH da solução a despeito da adição de ácido ou base à mesma. Os aminoácidos funcionam como ácidos fracos.
As curvas de titulação predizem a carga elétrica dos aminoácidos
A curva de titulação em dois estágios dos ácidos dipróticos apresenta um ponto de inflexão que é o ponto em que o ácido está totalmente ionizado, mas sem carga elétrica líquida. O pH característico no qual a carga total é igual a zero é denominado ponto isoelétrico ou pH isoelétrico (pI). Em solução, o aminoácido terá carga elétrica negativa em qualquer pH acima do seu pI e, portanto, mover-se-á em direção ao elétrodo positivo quando colocado em um campo elétrico. Em qualquer pH abaixo do seu pI, o aminoácido terá carga elétrica positiva e mover-se-á em direção ao eletrodo negativo. Quanto mais afastado o valor do pH do seu ponto isoelétrico, maior será a carga elétrica líquida da população de moléculas do aminoácido.
Os aminoácidos diferem em suas propriedades acidobásicas
Muitos aminoácidos diferentes compartilham propriedades comuns, o que permite algumas generalizações simplificadoras a respeito do comportamento acidobásico de suas diferentes classes. Todos os aminoácidos com um único grupo a-amino, um a-carboxila e um grupo R desprovido de grupos ionizáveis têm curvas de titulação com dois estágios. Os valores de pKa são muito similares, embora não idênticos, para todos eles. pKa do grupo carboxila na região de 1,8 a 2,4 e pKa do grupo amina na região de 8,8 a 11,0. Os aminoácidos com grupo R ionizável têm curvas de titulação mais complexas, exibindo três estágios correspondendo aos três passos de ionizações possíveis. Portanto, possuem três valores de pKa.
Apenas a histidina te um grupo R capaz de exercer função tamponante significativa próxima do pH neutro, usualmente encontrado nos fluidos intra e intercelulares da maioria dos animais e bactérias. Nenhum outro aminoácido tem a sua cadeia leteral com um valor de pKa próximo o bastante de pH 7,0 para que possa ser um tampão fisiológico efetivo.
Peptídeos e Proteínas
Os peptídeos que ocorrem biologicamente variam muito de tamanho, desde moléculas pequenas contendo apenas dois ou três aminoácidos até macromoléculas contendo milhares de aminoácidos.
Os peptídeos são cadeias de aminoácidos
A ligação de dois aminoácidos com a liberação de uma molécula de água e formação de um grupo amida entre o carbono carboxílico de um aminoácido e o nitrogênio do grupo amina do outro aminoácido é chamada ligação peptídica. Em pH fisiológico, essa reação, no entanto não ocorre diretamente, mas requer a formação de um intermediário. Quando mais aminoácidos são ligados desta maneira, tem-se a formação de oligopeptídeos ou polipeptídeos.
Em um peptídeo, os aminoácidos das extremidades são chamados de resíduo aminoterminal e resíduo carboxiterminal, segundo apresentem uma extremidade livre com amina ou carboxila livres, respectivamente.
Embora, a hidrólise das ligações peptídicas seja uma reação exergônica, ela ocorre lentamente por causa de sua alta energia de ativação.
Os peptídeos podem ser distinguidos entre si por meio de seu comportamento de ionização
Em um peptídeo, os resíduos de aminoácidos internos não apresentam grupo amina e carboxila ionizáveis, mas podem apresentar grupos ionizáveis em suas cadeias laterais. Assim, um dado peptídeo apresenta curva de titulação característica e pH isoelétrico característico, no qual não se moverá quando colocado em um campo elétrico. O peptídeo apresenta um grupo amina ou um grupo carboxila ionizável em cada uma de suas extremidades.
Peptídeos e polipeptídeos biologicamente ativos ocorrem em uma ampla faixa de tamanho
Nenhuma generalização pode ser feita com relação aos pesos moleculares de peptídeos e proteínas biologicamente ativos em relação a suas funções. Mesmo os menores peptídeos podem ter efeitos biológicos importantes – aspartame, oxitocina, bradicinina e amantina. Ainda considerados oligopeptídeos tem-se a insulina, o glucagon e a corticotropina. Mas as proteínas podem ter cadeia peptídica muito longa como é o caso da titina.
Algumas proteínas consistem de uma única cadeia polipeptídica, mas outras possuem dois ou mais polipeptídeos associados de forma não-covalente (multissubunitárias). As cadeias polipeptídicas individuais em um proteínas multissubunitária podem ser idênticas (a proteína é oligomérica e suas unidades são os protômeros) ou diferentes.
Pode-se calcular o número aproximado de resíduos de aminoácidos em uma proteína simples dividindo-se seu peso molecular por 110, levando-se em consideração as proporções em que os diversos aminoácidos aparecem na proteínas e o fato de que em cada reação de condensação para formação de uma ligação peptídica se perder uma molécula de água.
Os polipeptídeos possuem composições de aminoácidos características
A hidrólise completa de peptídeos ou proteínas com ácidos revela os tipos e proporções de aminoácidos que compõe cada proteína, que geralmente são muitos diferentes entre proteínas não relacionadas.
Algumas proteínas contêm outros grupos químicos além dos aminoácidos
Algumas proteínas contêm componentes químicos permanentemente associados além dos aminoácidos – proteínas conjugadas. A porção não-aminoácida é denominada grupo prostético – lipoproteínas contêm lipídios, glicoproteínas contêm carbonidratos, metaloproteínas contêm um metal específico. Algumas proteínas contêm mais de um grupo prostético. Geralmente, o grupo prostético tem um importante papel na função biológica das proteínas.
Existem diversos níveis de estrutura protéica
As proteínas podem apresentar quatro níveis estruturais. Uma descrição de todas as ligações covalentes unindo resíduos de aminoácidos em uma cadeia peptídica é a sua estrutura primária. A estrutura secundária se refere aos padrões estruturais decorrentes da seqüência de aminoácidos, enquanto a estrutura terciária se refere ao dobramento tridimensional de um polipeptídeo. Quando uma proteína possui duas ou mais subunidades polipeptídicas, seu arranjo espacial é denominado estrutura quaternária.
TRABALHANDO COM AS PROTEÍNAS
As proteínas devem ser purificadas para serem estudadas.
As proteínas podem ser separadas e purificadas
A fonte de uma proteína é geralmente tecido ou células microbianas. O primeiro passo, portanto, é o rompimento de células, liberando seu conteúdo – extrato bruto. O extrato é então submetido a um fracionamento que separa as proteínas em diferentes frações de acordo com suas propriedades (tamanho, carga). As etapas iniciais do fracionamento empregam diferenças na solubilidade das proteínas, que dependem de diversos fatores como o pH, a temperatura e a concentração salina. A solubilidade de uma proteína geralmente é reduzida em presença de altas concentrações salinas. A adição de um sal (por exemplo, o sulfato de amônio) em quantidades adequadas pode precipitar seletivamente algumas proteínas, enquanto outras permanecerão em solução. Em seguida, a solução com a proteína é submetida a um processo de diálise. Neste, a solução de proteína é colocada dentro de uma bolsa feita de membrana semipermeável, que permite a saída dos sais, mas não das proteínas. A bolsa é submetidas a sucessiva exposições a soluções tamponadas que removem sucessivamente o excesso do sal que foi utilizado para precipitar as proteínas. Na seqüência, a solução com proteínas pode ser submetida a um processo chamado cromatografia em coluna que separa as proteínas em função de suas cargas, tamanho, afinidade de ligação ou outras propriedades das proteínas. Uma técnica ainda mais refinada de cromatografia é o HLPC ou cromatografia líquida de alta eficiência. O HLPC utiliza bombas de alta pressão para acelerar o movimento das proteínas através da coluna, e assim obter maior resolução, porque diminui a difusão das proteínas.
As proteínas podem ser separadas e caracterizadas por eletroforese
As proteínas podem ser separadas com base na sua migração em um campo elétrico – eletroforese. Este método não é utilizado para purificar proteínas porque geralmente afeta de forma adversa a estrutura e, portanto, a função das proteínas. Mas é especialmente útil como método analítico. Pode ajudar a estimar rapidamente a quantidade e diversidade de proteínas em uma mistura, ou a determinar propriedades extremamente importantes de uma proteína (ponto isoelétrico e o peso molecular aproximado).
A eletroforese de proteínas é executada em géis de um polímero que apresenta ligações cruzadas, a poliacrilamida, que age como uma peneira molecular, alentecendo a migração de proteínas na proporção aproximada de sua razão entre carga e massa. Um método eletroforético comumente usado para estimar a pureza e o peso molecular utiliza o detergente dodecil sulfato de sódio (SDS). O SDS liga-se à maioria das proteínas e lhes confere uma carga altamente negativa, fazendo com que a carga da proteína se torne insignificante, além de alterar sua conformação nativa tornando as proteínas muito semelhantes. Portanto, a eletroforese na presença de SDS separa as proteínas quase exclusivamente com base em sua massa (peso molecular), com proteínas menores migrando mais rapidamente. Após a eletroforese, as proteínas são visalizadas pela adição de um corante (azul Coomassie) que se liga às proteínas, mas não ao gel.
A focalização isoelétrica determina o ponto isoelétrico de uma proteína (pI). Um gradiente de pH se estabelece em um gel sob ação de um campo elétrico após a adição de uma mistura de ácidos e bases orgânicas de baixo peso molecular. Se proteínas forem aplicadas neste gel sob um campo elétrico, elas migrarão até a faixa de pH em que apresentarem carga elétrica líquida igual a zero, ou seja, até seu ponto isoelétrico.
Proteínas que não foram separadas podem ser quantificadas
Em uma mistura protéica, pode-se conhecer a quantidade de uma proteína, medindo-se sua atividade. Quanto mais ativa, maior a quantidade da proteína. Neste caso, considera-se a unidade de atividade da proteína. No caso de enzimas, a unidade de atividade é definida como sendo a quantidade de enzima necessária para transformar um 1mmol do substrato por minuto a 25°C, sob condições ótimas de medida.
A ESTRUTURA COVALENTE DAS PROTEÍNAS
A função de uma proteína depende de sua seqüência de aminoácidos
A seqüência de aminoácidos tem um papel fundamental na determinação da estrutura tridimensional da proteína e de sua função: (1) proteínas com funções distintas possuem diferentes seqüências de aminoácidos; (2) em várias doenças genéticas, a proteína defeituosa apresenta uma única ou poucas alterações na seqüência de aminoácidos; (3) proteínas funcionalmente similares de espécies diferentes, apresentam seqüências de aminoácidos semelhantes. Mas, a seqüência de aminoácidos não é absolutamente fixa ou invariante. Alguma flexibilidade é possível. Estima-se que 20% a 30% das proteínas em seres humanos seja polimórficas, possuindo variantes em suas seqüências de aminoácidos.
As proteínas frequentemente apresentam regiões em sua seqüência de aminoácidos que são essenciais para suas funções biológicas. A seqüência de aminoácidos em outras regiões pode variar consideravelmente, sem afetar essas funções.
As seqüências de aminoácidos de numerosas proteínas já foram determinadas
Duas importantes pesquisas foram importantes para o início do sequenciamento de proteínas. O desvendamento do modelo estrutural do DNA por Watson e Crick (1953) e o sequenciamento da insulina por Frederick Sanger (1953).
Polipeptídeos pequenos são seqüenciados por procedimentos automatizados
Pode-se determinar primeiramente a composição de aminoácidos de uma dada proteína após a sua completa hidrólise.
A seqüência de aminoácidos é determina por processo de marcação do resíduo aminoterminal seguido de hidrólise do polipeptídeo. O aminoácido marcado é então identificado. A degradação de Edman marca e remove apenas o resíduo aminoterminal deixando as demais ligações peptídicas intactas. O peptídeo resultante apresenta um novo resíduo aminoterminal a cada ciclo, de forma que se pode determinar um a um os resíduos de aminoácidos de um dado peptídeo. Este procedimento no entanto tem limitação quanto ao comprimento da seqüência de aminoácidos. Estando limitadas a seqüência de aproximadamente 50 resíduos de aminoácidos.
Grandes proteínas devem ser seqüenciadas em segmentos menores
A exatidão global do seqüenciamento de aminoácidos diminui à medida que o comprimento da cadeia polipeptídica aumenta. Assim, primeiro se fragmenta as proteínas, antes de se determinar suas seqüências de aminoácidos. As etapas são rompimento das ligações dissulfeto, clivagem da cadeia polipeptídica (ação de proteases), sequenciamento de peptídeos (procedimento de Edman), ordenamento dos fragmentos peptídicos e localização das ligações dissulfeto.
As seqüências de aminoácidos também podem ser deduzidas por outros métodos
A espectrometria de massa permite o seqüenciamento de peptídeos curtos (20 a 30 aminoácidos) em apenas alguns minutos. O sequenciamento do DNA pode elucidar, também, a seqüência de resíduos de aminoácidos de um polipeptídeo, uma vez que são complementares.
O perfil protéico codificado pelo DNA de um organismo é chamado de proteoma.
A seqüência de aminoácidos fornece importantes informações bioquímicas
Várias proteínas podem ser agrupadas em famílias, e os membros destas famílias apresentam usualmente certas seqüências de forma similar. Assim, a determinação de uma seqüência de resíduos de aminoácidos em uma proteína pode indicar as funções desta.
Peptídeos pequenos e proteínas podem ser sintetizados quimicamente
Há três formas de se obter um peptídeo: (1) por purificação a partir de um tecido; (2) pela engenharia genética; e (3) pela síntese química direta.
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